Выявление возбудителей Сибирской язвы.
Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии в мазках-отпечатках, типичного роста на питательных средах и установлении патогенности путем заражения лабораторных животных.
Бациллы сибирской язвы обнаруживают в три последовательных этапа: бактериоскопия мазков из патологического материала; получение и изучение свойств чистой культуры на питательных средах; биологическая проба на лабораторных животных и при необходимости серологическое исследование. В случае доставки загнившего материала исследование проводят только по реакции преципитации.

 

Микроскопия мазков. 
При бактериоскопии мазков из патологического материала обращают внимание на форму и расположение отдельных микробов и наличие капсул. Характерный вид сибиреязвенных палочек и обилие их в мазке нередко позволяют поставить диагноз по результатам бактерйоскопического исследования.
Микроскопическому исследованию подвергают мазки из крови уха или другого материала. Для приготовления мазков из крови уха его рекомендуется приколоть шилом с двух противоположных сторон к доске, застеленной полиэтиленовой пленкой или пергаментом; затем отпрепарировать кожу, подрезать несколько кровеносных сосудов у основания уха и, проведя вдоль по сосуду скальпелем, выдавить каплю крови, которую этим же скальпелем наносят на предметное стекло для мазка и на поверхность агаровой среды у одного края чашки. Подсушенные мазки фиксируют на пламени или химическим методом, затем окрашивают по Граму и на капсулы — по Ребигеру, Ольту, 0,1 %-ным спирто-водным раствором метиленовой сини или другим способом.
В мазках, окрашенных по Граму, возбудитель сибирской язвы — прямая грамположительная палочка. Палочки располагаются короткими цепочками или попарно, концы их, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях в мазках (чаще от свиней) форма микробов сибирской язвы может быть нехарактерна: они имеют вид коротких, толстых, изогнутых или зернистых палочек со вздутием посередине или на концах.
В мазках из свежего патологического материала сибиреязвенные палочки окружены капсулой; в мазках из несвежего материала микробы нередко теряют характерную морфологию — они могут быть несколько увеличены, концы закруглены или наоборот - бациллы и слабоокрашенные капсулы как бы йзъедены.
По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

Культурально-биохимические свойства. 
Посевы из крови уха или другого патологического материала проводят не только на МПА в пробирках или чашках, но и на МПБ и выдерживают в термостате при температуре 36—37 °С в течение 18—24 ч. При отсутствии роста посевы оставляют в термостате еще 2 сут.
На МПА микроб образует плоские матово-серые шероховатые (R-форма) колонии с извилистым краем и локонообразными отростками, напоминающими под малым увеличением микроскопа "голову медузы", "львиную гриву". Встречаются и атипичные колонии с менее выраженной шероховатостью и без отростков. Молодые колонии имеют вязкую консистенцию.
МПБ после суточного роста сибиреязвенных микробов остается прозрачным, на дне образуется рыхлый из крупных хлопьев осадок в виде комка ваты. При встряхивании пробирок бульон не мутнеет, осадок, разбивается на мелкие хлопья. Иногда в МПБ возбудитель сибирской язвы дает диффузный рост (легкое помутнение), при встряхивании образуются муаровые волны.
Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках из типичной бульонной культуры обнаруживают длинные цепочки палочек, в то время как из бульонной культуры с диффузным ростом — отдельные или попарно расположенные палочки и редко — короткие цепочки.
Дифференциацию возбудителя сибирской язвы от сапрофитных бацилл, которые морфологически сходны, проводят по наличию капсул (в мазках из исходного материала или павших зараженных животных). В сомнительных случаях определяют подвижность посевом в полужидкий мясо-пептонный агар, гемолитические свойства на кровяных средах, характер роста на мясо-пептонном желатине, проводят люминесцентную микроскопию, фаготипирование, тест "жемчужного ожерелья", а также заражают лабораторных животных (см.табл.).
Дифференцирующие признаки микробов рода Bacillus

Микро

организмы

Подвиж ность Капсуло образо вание Гемо лити ческие свойства Рост на МПБ Рост на МПА Рост на жела­
тине в про­
бирке (посев
уколом)
Патогенность для
лабораторных
животных
Чувстви тельность к пеницил лину Чувстви тельность к специфи ческому фагу
Белые мыши Морские свинки Кролики
Вас. anthracis - + - Видимый рост
Через 6 - 7 ч
через 18 — 24 ч
осадок на дне
пробирки,
бульон проз­
рачный
Серо-белые
сухие волок­
нистые коло­нии, напоми­нающие голо­ву медузы
Перевернутая
елочка, среда
разжижается на 3 - 5-й день свер­ху
+ + + + +
Вас. cereus + - + Помут- нение,
трудно разби­
вающийся
крошко- ватый
осадок, плен­
ка и присте­
ночное кольцо
Плотные,
круглые, бе­
ловатые ко­
лонии, иног­
да окрашен­
ные в серо­
желтый цвет,
по краям из­
витые нити
Быстрое раз­
жижение, го­
ризонтальные
отростки от
укола
При массив­
ном внутри-
брюшинном
заражении
- - - -
Вас. anthraco- ides + - + Пому- тнение,
осадок в ви­
де хлопьев
Матовые во­
локнистые, с
отростками
колонии
Стеблеобраз­
ный рост с
утолщением,
сверху ворон­
ка
Не патоген­
на, редко
гибнут при
внутрибрю-
шинном заражении
большими
дозами
- - - -
Вас. pseudo- anthracis + - + Помут-нение,
с крошкова-
тым осадком
на дне, при­
стеночное
кольцо
Круглые бе­
ловатые с от­
ростками ло-
кончатые ко­
лонии
Чашкообраз­
ное разжиже­
ние
на, редко
гибнут при
внутрибрю-
шинном за­
ражении
большими
дозами
- - - -
Вас. megaterium + - - Помутнение
без пленки,
незначитель­
ный осадок
Матово-белые
морщинистые
колонии с от­
ростками
Воронкооб­
разное раз­
жижение
- - - - -
Вас. mesente- ricus + - - Муть с плен­
кой
Толстые мор­
щинистые
складчатые
матово-белые
колонии, на
конденсаци­
онной воде
пленка
То же - - - - -
Вас. mycoides + - + Бульон проз­
рачный, на дне
трудно разби­
вающийся оса­
док
Серовато-бе­
лые рыхлые
колонии
Быстрое раз­
жижение с об­
разованием
кратера
- - - - -
Вас. subtilis + - + Сначала помут­
нение, после
образо- вания
пленки буль­
он становится
прозрачным
Серовато-бе­
лые складча­
тые колонии,
пленка на кон­
денсате
На поверхно­
сти разжижен­
ного желатина
пленка
- - - - -

 


Исследование на подвижность проводят микроскопическим методом раздавленной или висячей капли или лучше путем посева исследуемой культуры уколом в столбик полужидкого агара (0,2—0,3%-ного). Посев ставят на 24 ч в термостат. Рост наблюдается по уколу, возбудитель сибирской язйы неподвижен.
Гемолитическую активность проверяют при посеве исследуемой культуры на кровяной агар или бульон. Результаты учитывают через 16—20 ч инкубации посевов в термостате. Возбудитель сибирской язвы гемолитической активностью не обладает, в то время как большинство сапрофитных спорообразующих бацилл дают бетта-гемолиз на агаре и вызывают гемолиз бульона с кровью.
Люминесцентную микроскопию проводят с использованием флуоресцирующих сибиреязвенных сывороток ”ОКВС” в соответствии с наставлением по их применению.
Фаготипирование проводят в соответствии с наставлением по применению фагов одним из следующих методов: стекающей капли, пробирочным или микрометодом с использованием сибиреязвенных бактериофагов "Гамма-МВА" или "К" ВИЭВ.

 

 

Тест "жемчужного ожерелья". 
Перед постановкой пробы готовят 3 пробирки по 10 см3 (или 3 колбы по 100 см3) МПА, в две из которых стерильно вносят пенициллин из расчета 0,5 и 0,05 ЕД на 1 см3 среды, третья остается контрольной. Агар разливают в чашки Петри и после застывания пробиркой с ровными краями делают насечки среды или вырезают пластинки 1,5 х 1,5 см, которые переносят на предметные стекла, помещенные в чашки Петри. На каждую пластийку делают высев 3-часовой бульонной культуры. Чашки закрывают крышками и помещают в термостат при 37 °С на 3 ч, а затем просматривают под микроскопом с сухой (объектив х 40) и иммерсионной системами, предварительно накрыв зону роста покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином принимают шаровидную форму, а их цепочки имеют вид "жемчужного ожерелья". Спорообразующие сапрофитные аэробные микробы вырастают в виде обычных форм. На контрольном агаре сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки, состоящие из типичных палочек.
Постановка теста указанным методом чрезвычайно неудобна и создает трудности в соблюдении мер безопасности при работе с патогенными культурами.
В соответствии с действующим в настоящее время ГОСТ 21237—75 постановку теста "жемчужное ожерелье" можно проводить непосредственно в 3 пробирках со скошенным мясо-пептонным агаром: в первой пробирке содержится 0,5, а во второй — 0,05 ЕД пенициллина в 1 см3, третья пробирка остается контрольной (без антибиотика). В каждую пробирку вносят по 0,25 см3 3-часовой бульонной тест-культуры. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С в наклонном положении (на деревянных рейках или стеклянных трубках). Через 3 ч петлей или пастеровской пипеткой из конденсационной жидкости берут материал и готовят мазки на предметных стеклах, высушивают их на воздухе, фиксируют спирто-эфирной смесью в течение 15 мин и окрашивают по Граму, метиленовой синью или водным раствором фуксина.
При положительной реакции теста "жемчужное ожерелье" бациллы сибирской язвы образуют цепочки из шарообразных форм, имеющих сходство с ожерельем из бус. Сапрофитные споровые аэробы, как правило, дают отрицательный результат при постановке этого теста, т. е. имеют форму палочек.
Заключительный учет теста в случаях отрицательных результатов рекомендуется проводить через 6 ч после инкубации посевов в термостате при температуре 37 °С.

Постановка реакции преципитации. 
Перед постановкой реакции свежий материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18 — 24 ч. Несвежий материал экстрагируют без выдерживания в термостате.
Экстрагирование проводят двумя способами: горячим или холодным. При этом следует учитывать, что экстракты, полученные горячим способом, беднее преципитиногенами, чем при холодном.
Горячий способ: кусочки исследуемого материала (1—2 г) помещают в пробирку или колбу, заливают физиологическим раствором в соотношении 1 : 10 и кипятят в течение 30—40 мин.
Холодный способ: кусочки материала (1 —2 г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу или баночку, заливают карбонизированным (0,5 %-ным) физиологическим раствором в соотношении 1 : 10 и оставляют на 16 —18 ч при комнатной температуре.
Полученные экстракты фильтруют через асбестовую нейтральную вату до полной прозрачности, причем первые капли фильтрата удаляют.
Реакцию преципитации ставят путем наслаивания или по дотаивания. При наслаивании в узкую пробирку наливают 0,2—0,3 см3 прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаивают равное количество экстракта так, чтобы между компонентами была ясно выраженная граница (тонкая прямая линия).
При подслаивании в пробирку сначала вносят 0,2—0,3 см.куб. экстракта, затем под него осторожно пастеровской пипеткой подслаивают равное количество преципитирующей сыворотки.
Одновременно ставят контроли: заведомо сибиреязвенный антиген с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой; нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом и преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором. В первом контроле на границе антигена и сыворотки должно образоваться белое кольцо, во втором и третьем — отсутствие кольца,
Реакцию считают положительной, если через 3—8 мин появляется кольцо преципитации; сомнительной, если оно образуется через 10 — 15 мин, и отрицательней — при отсутствии на границе между компонентами кольца.

Постановка биологической пробы. 
Заражение лабораторных животных исходным материалом является обязательным и проводится в день поступления материала. Исследуемый патологический материал, суспендированный в небольшом объеме физиологического раствора, вводят двум белым мышам в дозе 0,1 -0,2 см3 (по ГОСТу - 0,5 см3) подкожно в заднюю часть спины или двум морским свинкам в дозе 0,5 — 1 см3 подкожно в область живота. Гибель зараженных животных наступает через 1 -3 сут, иногда позже. Наблюдение за подопытными животными ведут 10 дней.
При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) подопытных животных заражают только полученной чистой культурой,
В случае гибели лабораторных животных их вскрывают, делают мазки и посевы из крови сердца, селезенки, печени, инфильтрата на месте инъекции исследуемого материала.
Срок бактериологического исследования мяса вынужденно убитых животных в ветеринарной лаборатории не должен превышать 3 дней, а при постановке биологической пробы — 10 дней (Инструкция о мероприятиях против сибирской язвы от 5 июня 1981 г. с дополнениями 12 ноября 1982 г.).

Учет результатов исследования. 
Диагноз на сибирскую язву считается установленным при получении одного из следующих показателей:
выделение из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы, и гибель хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных исходным материалом или полученной культурой с последующим выделением ее из органов павшего животного;
отсутствйе в посевах из исходного материала роста культуры, но гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных и выделение из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы;
получение положительных результатов методом иммунофлуоресценции с адсорбированной сибиреязвенной сьюороткой и обнаружение капсульных бацилл в мазках из исходного патологического материала;
положительная реакция преципитации при исследовании загнившего патологического материала.

Ветеринарно-санитарная оценка. 
При установлении бактериоскопическим исследованием сибирской язвы тушу со всеми органами и шкурой, не ожидая результатов бактериологического исследования, направляют на уничтожение сжиганием при соблюдении установленных ветеринарно-санитарных правил.
Все обезличенные продукты (ноги, уши, вымя, кровь и др.), полученные от убоя других животных, смешанные с продуктами убоя от сибиреязвенного животного сжигают.
Помещение, где проведен убой животного, оборудование, инвентарь подлежат дезинфекции; рабочие проходят санитарную обработку по указанию и под наблюдением медико-санитарного надзора.
Другие туши и продукты убоя, подозреваемые в обсеменении бациллами сибирской язвы по ходу технологического процесса, немедленно подвергают обеззараживанию проваркой, но не позднее 6 ч с момента убоя, в открытых котлах в течение 3 ч с начала закипания, а в закрытых котлах при температуре 112 °С и давлении 0,05 МПа — в течение 2,5 ч. Если отсутствует возможность провести обеззараживание в указанный срок, туши изолируют при температуре не выше 10 °С, а затем направляют на обеззараживание, но не позднее 48 ч с момента убоя. В том случае, когда это выполнить нельзя, туши и продукты убоя, подлежащие обеззараживанию, направляют на утилизацию или сжигание.
При отрицательном результате бактериоскопического исследования тушу, подозреваемую в заражении сибирской язвой, изолируют до получения заключения о результатах бактериологического исследования. После подтверждения диагноза, а также в случае сомнительного результата бактериоскопического исследования и отсутствия возможности изолировать тушу, подозреваемую в заражении сибирской язвой, до установления бактериологического диагноза, тушу животного и зараженные органы утилизируют, после чего проводят дезинфекцию помещения.