Производственная инструкция для сотрудников бактериологической лаборатории (Микробиолога)
Выявление бактерий рода Proteus из мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих. (по ГОСТ Р 50396.7-92)
1. Область применения:
Настоящая инструкция применяется сотрудниками лаборатории (бактериологического отдела), при необходимости выявления бактерий рода Proteus из мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих.
2. Цель:
Выявление бактерий рода Proteus из мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих в соответствие с ГОСТ Р 50396.7-92.
Требования безопасности:
3.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности безопасность при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
3.2 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности безопасность при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) по ГОСТ Р ИСО 7218.
3.3 Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.1.004.
3.4 При работе с электроприборами необходимо соблюдать правила электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.
4. Метод:
4.1 Применяемые аппаратура, материалы и реактивы
- весы неавтоматического действия EW-1500i (для взвешивания реактивов);
- весы электронные KERN 440-43 (для взвешивания продукта);
- лупа с увеличением 5-10
- микроскоп для морфологических исследований «МИКМЕД-1» биологический с увеличением 900-1000
- петля бактериологическая;
- стекла предметные
- гомогенизатор лабораторный
- Аквадистиллятор электрический ДЭ-10
- Термостат-инкубатор с естественной конвекцией «BINDER» ВD 115, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.
- Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), с диапазоном измерения от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С.
- Шкаф сушильный ШС – 80-01 СПУ
- Спиртовка
- Емкости металлические или кастрюли, используемые для растворения, расплавления, нагревания или охлаждения питательных сред и воды.
- ножи;
- ножницы;
- палочки стеклянные
- пинцеты
- пипетки разной вместимости;
- плитка электрическая
- рН-метр;
- промывалка;
- Вата медицинская гигроскопическая
- Колбы мерные 2-50(100, 200, 500, 1000)
- Колбы конические Кн-2-100(250)-34 ТХС
- Цилиндры 1(2)-50(100)
- Пробирки П1, П2-16-150 ТС
- Чашки Петри 90 мм
- Стаканчики для взвешивания (бюксы)
- Пакеты для гомогенизации
- Вода дистиллированная
- Спирт этиловый ректификованный
- Стерилизатор паровой ВК-75-01
- Стерилизатор паровой ВК-75- ПЗ
- Холодильник-морозильник ХМ-4421-000-N «Атлант»
- Холодильник бытовой «Бирюса 542»
- Холодильник фармацевтический ХФ-250 «ПОЗИС»
- Холодильный шкаф «Хелкама» С5G
4.2. Питательные среды
4.2.1 Общие указания по приготовлению и стерилизации культуральных сред - по ГОСТ ISO 11133.
4.2.2 Мясо-пептонный агар - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.3 Мясо-пептонный агар с глюкозой - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.4 Среда Плоскирева - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.5 Растворы для окрашивания по Граму - по ГОСТ 7702.2.0, ГОСТ 10444.1, ГОСТ ISO 7218.
4.2.6 Мясо-пептонный бульон - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.7 Агар тройной сахарный с цитратом железа - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.8 Агар трехсахарный по Олькеницкому - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.9 Среда из сухого питательного агара с глюкозой - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.10 Среда для расщепления фенилаланина - по ГОСТ 7702.2.0.
4.2.11 Раствор железа трех-хлорного 6-водного с массовой долей 8,0% - по ГОСТ 7702.2.0
5. Отбор и подготовка проб
5.1 Методы отбора проб и подготовка их к исследованиям - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 со следующими дополнениями.
5.1.1 Для контроля качества тушек или полутушек птицы из области грудной части, голени и бедра вырезают на всю глубину мышцы в равных количествах общей массой не менее 150 г, измельчают их с соблюдением правил асептики с помощью ножниц, гомогенизатора в течение 2-2,5 мин или фарфоровой ступки с пестиком, перемешивают и получают объединенную пробу одной тушки или полутушки.
5.1.2 Объединенную пробу обваленного, измельченного мяса, птичьих субпродуктов и полуфабрикатов отбирают по нормативно-технической документации на эти виды продуктов.
5.1.3 Для приготовления исходного разведения из объединенной измельченной пробы отбирают навеску не менее 10 г.
5.1.4 Для исследования микробного загрязнения поверхности тушек, их частей, обваленного мяса, субпродуктов, полуфабрикатов (кроме панированных и измельченных) пробы отбирают в виде смывов, полученных с помощью ватных тампонов по ГОСТ 26669, или стерильной жидкостью для смыва (пептонной водой, физиологическим раствором, водопроводной водой).
5.1.5 При отборе проб в виде смывов жидкостью в новый стерильный пакет одноразового пользования из полимерного материала помещают тушку птицы или ее части массой не более 1,5 кг, объединенную пробу обваленного мяса или субпродуктов массой не менее 150 г, добавляют жидкость для смыва в количестве, равном массе исследуемого продукта. Встряхивают содержимое пакета в течение 2 мин. Полученная смывная жидкость служит исходным материалом для последующих 10-кратных разведений.
5.1.6 При выявлении микроорганизмов из мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов для посевов на питательные среды используют верхний слой надосадочной жидкости, а при определении их количества используют взвесь исходного разведения.
6. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
6.1 Из навески продукта готовят исходное и ряд 10-кратных разведений по ГОСТ 26669 для определения предполагаемого минимального количества продукта, содержащего бактерии рода Proteus. Арбитражные исследования проводят по ГОСТ 28560, в других случаях по методу, указанному ниже.
6.2 Для обнаружения Н-форм Proteus в конденсационную воду пробирок со свежескошенным питательным агаром по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.2; 2.4.5 вносят 0,5 см3 анализируемой взвеси, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича). Вертикально поставленные пробирки с посевами инкубируют при температуре (37±1) °С, просматривают через 18-24 ч.
При росте культуры из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды с образованием ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком определяют морфологию микроорганизмов микроскопированием мазков по ГОСТ 36425.
6.3 Для обнаружения не роящихся О-форм проводят посевы по 0,2 см исследуемой взвеси продукта на поверхность агара Плоскирева, инкубируют при температуре (37±1) °С. Посевы просматривают через 18-24 ч. Прозрачные колонии с характерным запахом, слегка подщелачивающие среду, с окрашиванием ее в желтый цвет, подвергают микроскопическим исследованиям.
6.4 Бактерии рода Proteus являются неспорообразующими полиморфными грамотрицательными палочками. При необходимости производят пересевы для получения чистых культур и используют их для биохимических тестов.
Для получения чистых культур используют мясо-пептонный бульон или скошенный в пробирках мясо-пептонный агар. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±1) ч.
6.5 Не менее 5 колоний чистой культуры используют для биохимических тестов (ферментация глюкозы, образование сероводорода, дезаминирование фенилаланина).
6.5.1 Для определения ферментации глюкозы и образования сероводорода чистую культуру высевают штрихом и уколом в пробирки со скошенным трехсахарным агаром. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (48±1) ч.
Бактерии рода Proteus ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, при этом скошенная поверхность среды окрашивается в ярко-красный цвет, а в столбике появляется газ.
Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом столбик среды чернеет.
6.5.2 Для определения дезаминирования фенилаланина суточную чистую культуру высевают штрихами на поверхность скошенного агара и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (48±1) ч. Затем на поверхность агара с выросшей культурой наносят 3-5 капель раствора хлорного железа. Появление интенсивной зеленой окраски - реакция положительная. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.
Бактерии рода Proteus дезаминируют фенилаланин.
7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
7.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
7.2 Выделенные микроорганизмы относят к бактериям рода Proteus при обнаружении неспорообразующих грамотрицательных полиморфных палочек, ферментирующих глюкозу, образующих сероводород, дезаминирующих фенилаланин.
7.3 Результаты исследований записывают: бактерии рода Proteus обнаружены или не обнаружены, при этом указывается навеска исследуемого продукта.
8. Ответственность:
За выполнение данной инструкции несет ответственность сотрудник бактериологической лаборатории, выполняющий выявление бактерий рода Proteus из мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих.
9. Ссылки и сокращения:
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями N 1, 2)
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (с Изменением N 1)
ГОСТ Р 50396.0-2013 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям
ГОСТ Р 53597-2009 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям (с Поправкой)
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 7702.2.0-2016 Продукты убоя птицы, полуфабрикаты из мяса птицы и объекты окружающей производственной среды. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям (с Поправкой)
