Производственная инструкция для сотрудников бактериологической лаборатории
(Микробиолога)
Выявление Escherichia coli в мясе (все виды убойных животных), полуфабрикатах, субпродуктах, колбасных изделиях и продуктах из мяса.
(по ГОСТ Р 54354 п. 8.7.1)
1. Область применения:
Настоящая инструкция применяется сотрудниками лаборатории (бактериологического отдела), при необходимости обнаружения Escherichia coli (E. coli) в мясе (все виды убойных животных), полуфабрикатах, субпродуктах, колбасных изделиях и продуктах из мяса.
2. Цель:
Обнаружение предполагаемых Escherichia coli (E. coli) в мясе (все виды убойных животных), полуфабрикатах, субпродуктах, колбасных изделиях и продуктах из мяса в соответствие с ГОСТ Р 54354-2011
Требования безопасности:
3.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности безопасность при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
3.2 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности безопасность при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности).
3.3 Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности, и иметь средства пожаротушения.
3.4 При работе с электроприборами необходимо соблюдать правила электробезопасности.
4. Метод:
4.1 Применяемые аппаратура, материалы и реактивы
- весы неавтоматического действия EW-1500i (для взвешивания реактивов);
- весы электронные KERN 440-43 (для взвешивания продукта);
- лупа с увеличением 5-10
- микроскоп для морфологических исследований «МИКМЕД-1» биологический с увеличением 900-1000
- петля бактериологическая;
- стекла предметные
- гомогенизатор лабораторный
- Аквадистиллятор электрический ДЭ-10
- Термостат-инкубатор с естественной конвекцией «BINDER» ВD 115, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.
- Термостат электрический суховоздушный ТС-1/80 СПУ
- Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), с диапазоном измерения от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С.
- Шкаф сушильный ШС – 80-01 СПУ
- Спиртовка
- Емкости металлические или кастрюли, используемые для растворения, расплавления, нагревания или охлаждения питательных сред и воды.
- ножи;
- ножницы;
- палочки стеклянные
- пинцеты
- пипетки разной вместимости;
- плитка электрическая
- рН-метр;
- промывалка;
- Вата медицинская гигроскопическая
- Колбы мерные 2-50(100, 200, 500, 1000)
- Колбы конические Кн-2-100(250)-34 ТХС
- Цилиндры 1(2)-50(100)
- Пробирки П1, П2-16-150 ТС
- Чашки Петри 90 мм
- Стаканчики для взвешивания (бюксы)
- Вода дистиллированная
- Спирт этиловый ректификованный
- Стерилизатор паровой ВК-75-01
- Стерилизатор паровой ВК-75- ПЗ
- Холодильник-морозильник ХМ-4421-000-N «Атлант»
- Холодильник бытовой «Бирюса 542»
- Холодильник фармацевтический ХФ-250 «ПОЗИС»
- Холодильный шкаф «Хелкама» С5G
4.2 Питательные среды и реактивы
4.2.1 Реактив Кларка
4.2.2 Реактивы Ковача и Эрлиха
4.2.3 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью
4.2.4 Спиртовой раствор ὰ-нафтола
4.2.5 Бульон Мак-Конки
4.2.6 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой
4.2.7 Бульон мясо-пептонный с триптофаном
4.2.8 Бульон Хоттингера
4.2.9 Среда Кесслер
4.2.10 Среда Кларка
4.2.11 Среда (типа Клиглера)
4.2.12 Среда Козера
4.2.13 Среда Симмонса
4.2.14 Среды с углеводами (среды Гисса)
4.2.15 Среда Эндо
4.2.16 Трехсахарный агар
5. Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб по по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.
6. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
6.1 Посевы для определения количества E.coli в 1 г (см3 ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli) продукта и выявления Е.соli в определенной навеске продукта проводят по ГОСТ 30518.
Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24±3) ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через (48±3) ч.
Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).
6.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение (24±3) ч.
6.3 Посевы на агаризованной среде по 6.1 и 6.2 просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для Е.соli колоний.
На среде Эндо Е.соli образуют колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.
Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.
Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ГОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.
Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36±1) °С.
6.4 У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1,1꞉1,5х2꞉6 мкм ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli), выросших в пересевах по 6.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.
6.4.1 Определение образования индола
Культуру высевают в пробирку с бульоном Хоттингера, приготовленным по 6.2.5, или мясо-пептонным бульоном с триптофаном, приготовленным по 6.2.4. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки, приготовленной по 6.1.4. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового.
Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача, приготовленных по 6.1.2. Для этого к 5 см3 ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli 24-часовой культуры добавляют 1 см3 ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli одного из реактивов. Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию.
E.coli образует индол.
6.4.2 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра)
Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.
После инкубирования посевов к 1 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coliраствора ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli-нафтола, приготовленного по 6.1.3, и 0,2 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli раствора гидроокиси калия, приготовленного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Проявление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию.
E.coli не образует ацетоин.
6.4.3 Определение утилизации цитрата
Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.
E.coli не утилизирует цитрат.
6.4.4 Определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот)
Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч. К 5 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli культуральной жидкости прибавляют 5-10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до рН ниже 5,0.
E. coli интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).
6.4.5 Определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы
Культуру высевают в среды Гисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч, а на среде Гисса с лактозой при температуре (44±1) °С в течение 24 ч.
E. coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.
При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках трехсахарного агара или среды Клиглера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.
Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Клиглера.
Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.
У культур типичных для Е. соli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Е. соli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.
6.4.6 Определение образования сероводорода
Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Клиглера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.
Е. соli не образует сероводород.
7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
7.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
7.2 К бактериям Е.соli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре (44±1) °С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, необразующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для Е.соli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам Е.соli.
7.3 Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены Е.соli.
7.4 Результаты определения количества Е.соli и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.
9. Ответственность:
За выполнение данной инструкции несет ответственность сотрудник бактериологической лаборатории, выполняющий определение Е.соli в мясе (все виды убойных животных), полуфабрикатах, субпродуктах, колбасных изделиях и продуктах из мяса.
10. Ссылки и сокращения:
ГОСТ 26670-91 - Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (с Изменением N 1)
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями N 1, 2)
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae
