При подозрении на листериоз бактериологическая диагностика включает микроскопическое исследование исходного материала, посевы на питательные среды, идентификацию выделенных культур по культурно-биохимическим и серологическим свойствам, а также постановку биологической пробы на лабораторных животных.
Морфологические и культуральные свойства. Микроскопическому исследованию подвергают тонкие мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. При приготовлении мазков-отпечатков - чистым предметным стеклом 3—4 раза прикасаются к поверхности среза органа. Мазки готовят непосредственно из материала, а также после выдержки (подращивания) проб в термостате в течение 4—6 часов. Мазки окрашивают по Граму, а также методами флуоресцирующих антител.
Возбудитель листериоза — полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5—2,0 мкм; она хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками, грамположительна (однако в старых культурах могут встречаться единичные грамотрицательные палочки).

Люминесцентно-серологическое исследование проводят с использованием прямого и непрямого методов флуоресцирующих антител в соответствии с Наставлением по лабораторной диагностике листериоза животных (от 1971 г. с изменением от 31 июля 1974 г)*. С помощью двух методов можно идентифицировать возбудителя в культурах, обнаружить листерии в органах и тканях, а также определить их серогрупповую принадлежность.
Для выделения культуры листерий из органов и обязательно из головного мозга проводят обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию из головного мозга и паренхиматозных органов на физиологическом растворе в соотношении 1 : 5 и из нее делают посевы. Для культивирования листерий используют обычный или печеночный агар и бульон с добавлением 1% глюкозы и 2—3% глицерина (pH среды 7,2—7,4), а также кровяной агар и специальные среды.
При хранении патологического материала в холодильнике при +4 °С происходит размножение и накопление листерий. Поэтому в качестве дополнительного метода рекомендуется часть исследуемого материала помещать в холодильник и сохранять в течение 30 дней для проведения повторных исследований через каждые 10 дней при отрицательном результате первичного посева. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С с ежедневным просмотром в первые 3—4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение 2 недель.
Характерным для возбудителя листериоза является легкое помутнение бульона и появление мелких росинчатых колоний на агаре, наличие бетта-гемолиза на кровяном агаре. Просмотр посевов на плотных средах целесообразнее проводить с использованием осветителя ОИ-19 с голубым фильтром в проходящем свете: колонии листерий имеют в отличие от колоний других микроорганизмов голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру. Выделенные культуры изучают микроскопически с окраской мазков по Граму, а также с применением прямого и непрямого методов флуоресцирующих антител.
При получении смешанной культуры ее очищают общепринятыми методами, а также путем заражения молодых белых мышей массой до 16 г. Определение подвижности проводят методом висячей или раздавленной капли. На подвижность исследуют 6 — 12-часовую бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре. Листерии, выращенные при данной температуре, обладают активной подвижностью.
Для определения ферментативных свойств чистую культуру пересевают на пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, рамноза, салицин, трегалоза, дульцит, инулин, раффиноза). Листерии разлагают с образованием кислоты (без газа) глюкозу, мальтозу, рамнозу, салицин, трегалозу и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу.
Ставят пробу на каталазу. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленного 5%-ного пероксида водорода, при исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель пероксида водорода. При наличии фермента каталазы пероксид водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пены). Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий.
Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней можно использовать индикаторные среды, метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерий.
Исследуемую бульонную культуру или смыв агаровой культуры засевают в объеме 2—4 капель не менее чем на 2 индикаторные среды: например, с нейтральным красным в смеси с метиленовой синью, метиловым красным. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37—38 °С вместе с контрольными (незасеянными) средами. Результат учитывают через 3; 6; 24 и 48 ч.
Возбудитель листериоза через 3—6 ч обесцвечивает среду с нейтральным красным в смеси с метиленовой синью до цвета бульона, лишь у поверхности на границе с воздухом остается окрашенный ободок. При встряхивании цвет частично восстанавливается, поэтому посевы просматривают, не встряхивая пробирки. Среда с метиловым красным обесцвечивается через 3—6 ч, но восстановления цвета среды не происходит, Контролем служат незасеянные индикаторные среды. Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред.
Серотипизация. Серологическая идентификация листерий проводится с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой, представляющей собой смесь кроличьих листериозных агглютинирующих сывороток и содержащей факторы (антитела) Н-АВ и О-II, V, VII, IX. Поливалентная сыворотка в капельной реакции агглютинации на стекле агглютинирует все известные серотипы и подтипы листерий. Типовые сыворотки агглютинируют культуры листерий соответствующих типов ("серогрупп"). Сыворотка 1-го серотипа (серогруппы) содержит 0-фактор II, а сыворотка 2-го серотипа (серогруппы) — О-факторы V, VI. Серологическая типизация листерий осуществляется в соответствии с Наставлением по лабораторной диагностике листериоза.
Постановка биологической пробы. Для определения вирулентных свойств ставят биопробу. Биологическое исследование проводят на 2—3 белых мышах массой 18 г. Суспензию из головного мозга и внутренние органов или культур вводят животным под кожу или внутрибрюшинно в дозе 0,3—0,5 см3. Для повышения эффективности биопробы мышам за 3 —4 ч до заражения инъецируют внутримышечно кортизон в дозе 5 мг. При положительной биопробе животные погибают через 2—6 сут после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. В отдельных случаях этих поражений может не быть.
Очень чувствительны к подкожному заражению 5 - 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18—36 ч. К заражению листериями восприимчивы и кролики при внутривенном заражении культурой листерий в дозе 0,5 — 1 млрд. микробных тел .
Из внутренних органов павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды. Срок наблюдения за подопытными животными - 14 сут.

Дифференциация листерий от возбудителя рожи.
При бактериологическом исследовании мяса на листериоз и рожу свиней (срок исследования — 7 лет) проводят дифференциацию выделенных культур по морфологическим, биохимическим признакам и вирулентности (данные представлены в табл.).

Таблица. Дифференцирующие признаки листерий и возбудителя рожи свиней

Таблица. Дифференцирующие признаки листерий и возбудителя рожи свиней

Признак Возбудидель листериоза Возбудитель рожи свиней
Морфология в мазках - отпечатках Неспорообразующие короткие палочка с закругленными концами. Располагаются поодиночке, попарно, в форме римской цифры V . Неспорообразующие, тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки, иногда нити.
Рост на МПА Мелкие росинчатые, прозрачные колонии.  Через 2-3 суток наблюдается помутнение колоний. Мелкие росинчатые, прозрачные колонии.
Рост на МПБ Небольшое помутнение с образованием слизистого осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички. Легкое помутнение, поднимающегося при встряхивании осадок в виде облака.
Морфология в мазках из культуры Короткие, прямые, овоидные палочки, иногда почти кокки, располагаются поодиночке или кучками. Короткие, прямые или слегка изогнутые палочки; При хроническом течении инфекции- как короткие, тонкие палочки, так и удлиненные цепочки и нити.
Окраска по Граму Положительная Положительная
Подвижность Подвижен в молодой 6-12 часовой культуре, выращенной при комнатной температуре. Неподвижен
Салицин Разлагает Не разлагает
Проба на каталазу Положительная Отрицательная
Индикаторные среды Обесцвечивает Не обесцвечивает
РА с позитивной листериозной сывороткой Положительная Отрицательная
Коньюктивальная проба на морских свинках Положительная Отрицательная
Внутрикожная проба Положительная Отрицательная

 

При необходимости дополнительной дифференциации бактерий листериоза от бактерий рожи свиней применяют посевы: на питательный желатин, на углеводную среду с салицином, на мясо-пептонный печеночный агар с 0,01 % теллурита калия, на мясо-пептонный агар с кровью, а также ставят конъюнктивальную пробу на морских свинках.
Бактерии листериоза в отличие от бактерий рожи свиней на желатине дают медленный рост в виде узловатой нити с неровными краями и пушистыми отростками, желатин не разжижают, ферментируют салицин, вызывают гемолиз на агаре с кровью, растут на мясо-пептонном печеночном агаре с 0,5 % глюкозы, 3 % глицерина и 0*01 % теллурита калия в виде мелких черных колоний и вызывают кератоконъюнктивит у морских свинок.

Ветеринарно-санитарная оценка при пастереллезе, роже свиней и листериозе.
Туши и все субпродукты от больных и подозрительных по заболеванию животных выпускать в сыром виде запрещается.
При истощении и наличии дегенеративных или других патологических (абсцессы) изменений в мускулатуре - туша со всеми внутренними органами подлежит утилизации.
При отсутствии патологических изменений в туше и внутренних органах решение об использовании их принимают после бактериологического исследования (за исключением листериоза) на сальмонеллы; при обнаружении в мышцах или внутренних органах сальмонелл внутренние органы направляют на утилизацию или уничтожают, а туши выпускают после проварки или перерабатывают на консервы.
При отсутствии патологических изменений в мускулатуре туши, но отрицательном результате бактериологического исследования на сальмонеллы туши обезвреживают действием высокой температуры (проварка, изготовление мясных хлебов и консервов) по установленным режимам, а внутренние органы направляют на утилизацию или уничтожение. При отсутствии сальмонелл тушу, шпик и внутренние органы разрешается перерабатывать на вареные или варено-копченые колбасы, а также на варено-копченые грудинки и корейки или консервы с соблюдением установленного термического режима или направляют на проварку.
Внутренние органы, кишки и кровь, имеющие патологические изменения, а также головы от больных листериозом животных во всех случаях направляют на утилизацию с обезвреживанием при температуре не ниже 100 °С или проварку при этой же температуре в течение 1 ч.
Шкуры дезинфицируют согласно наставлению по их дезинфекции. При пастереллезе птицы внутренние органы утилизируют, тушки направляют на проварку, прожарку или на переработку на консервы. При листериозе — голову и пораженные органы утилизируют. Тушки и непораженные органы проваривают. При рожистой септицемии внутренние органы утилизируют, а тушку при отсутствии изменений в мышцах проваривают, при наличии дегенеративных изменений утилизируют.

 И в заключение - фильм, созданый специалистами ВНИИМП, о пищевом листериозе и методах его определения в продуктах питания:

{videobox}icGUFXzP06I{/videobox}

{jcomments on}