Для выделения, культивирования и идентификации микроорганизмов в лабораторных условиях используют различные искусственные питательные среды, которые в зависимости от назначения подразделяют на группы:
-обычные, или простые, - для выращивания большинства аэробов и факультативных анаэробов;
-специальные - для культивирования микробов, которые не растут или дают слабый рост на простых питательных средах;
-селективные - для выделения культур одною рода или вида, имеющих преимущество в размножении перед другими представителями микрофлоры;
-дифференциально-диагностические предназначенные для выявления культурально-биохимических особенностей бактерий,
-среды накопления (обогащения) - употребляемые для увеличения численности микробов, наличие которых в исследуемом материале незначительно, при подавлении роста посторонней микрофлоры.
Основой большинства питательных сред животного происхождения является мясная вода, для некоторых - печеночная вода.
Мясная вода. Свежую нежирную говядину или конину освобождают от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку или нарезают мелкими кусочками, заливают дистиллированной (водопроводной) водой в соотношении 1 : 2 (на 500 г мяса 1000 см3 воды) и выдерживают 15 - 18 ч в прохладном месте. Затем настой кипятят в течение 40 мин - 1 ч и снимают накипь. После кипения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают дистиллированной (водопроводной) водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С и давлении;
Печеночная вода. Свежую говяжью печень, освобожденную от жира пленок, Измельчают на мясорубке и заливают водопроводной водой из расчета 1 : 2, настаивают в течение 1 ч и кипятят 30 мин при постоянно помешивании. После отстаивания фарш удаляют, доводят до первоначального объема дистиллированной водой и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разлитую по колбам печеночную воду стерилизуют 30-40 мин при температуре 112 °С и давлении 0,05 МПа.
Основной раствор (перевар) Хоттингера. 1000 г мяса (говядины или конины), освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками по 1-2 см, которые опускают небольшими порциями в кастрюлю с 2000 см3 кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15-20 минут до свертывания белков (цвет мяса станет серым). Мясо вынимают шумовкой и пропускают через мясорубку, а оставшуюся жидкость фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 8,0. Затем фильтрат соединяют с фаршем, охлаждают до температуры 40 °С в открытой кастрюле и добавляют дважды измельченную поджелудочную железу, предварительно очищенную от жира, соединительной ткани, в количестве 10% к полученной взвеси (на 1000 см3 жидкости 100 г железы) или 0,9 -1,0 % сухого панкреатина (в зависимости от его активности).
Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают 10%-ным раствором гидроксида натрия или питьевой содой до pH 7,8-8,0. Смесь переливают в бутыли с хорошо подобранной резиновой пробкой на 2/3 их объема и добавляют на каждый литр смеси 10 см3 х. ч. хлороформа; закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего, открыв пробку, удаляют пары хлороформа, а бутыль снова закрывают.
Через 1-2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают pH 7,4-7,6 и оставляют смесь для переваривания на 7 -16 сут при комнатной температуре до образования осадка. Первые 3-4 сут переваривания ежедневно встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки, в дальнейшем встряхивать можно реже. За 1- 2 сут до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся.
Можно ферментативное переваривание проводить в термостате при температуре 40-42 °С в течение 2 сут. Содержимое бутыли взбалтывают 2-3 раза в сутки с открыванием пробки. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет. Готовый перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 °С. Приготовленный гидролизат можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость вновь фильтруют.
Химические показатели готового перевара Хоттингера должны быть следующими: общего азота 900-1200 мг%, амииного азота 600- 750 мг%, триптофана 200-300 мг%
(Свободный триптофан можно обнаружить в качественной реакции, происходящей в кислой среде при взаимодействии его с препаратами хлора; с этой целью к 5 куб. см. питательной среды добавляют 2 капли уксусной кислоты, тщательно перемешивают и вносят несколько капель1%-го водного раствора хлорамина - появление розовой окраски свидетельствует о наличии триптофана.).
Пептонная вода. К 1000 см3 дистиллированной воды добавляют 10-20 г пептона и 5 г хлорида натрия, кипятят 30 мин до растворения пептона, устанавливают pH 7,2-7,4, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности, после чего стерилизуют 30 мин при давлении 0,1 МПа и температуре 120 °С.
Пептонная вода может быть использована взамен мясо-пептонного бульона.
Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1000 см3 мясной воды добавляют 10 г сухого пептона и 5 г хлорида натрия, кипятят в течение 30 мин, устанавливают необходимую реакцию, после чего добавляют воду до первоначального объема. Бульон фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (питьевой соды) или 10 %-ным раствором гидроксида натрия требуемую реакцию, стерилизуют 15 -20 мин при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа.
Мясо-пептонный бульон предназначен для культивирования аэробных микроорганизмов и изучения показателей роста в жидкой питательной среде по помутнению среды, наличию и характеристике осадка, образованию пристеночного кольца, пленки.
Мясо-пептонный агар (МПА). К 1000 куб.см. мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного его растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50-55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см3 мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в кипящую водяную баню, чтобы белок свернулся. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем pH 7,2-7,4, разливают в колбы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С.
Мясо-пептонный агар предназначен для культивирования аэробов и изучения характера роста микробов по величине и форме колоний, линии края, цвету, блеску, прозрачности, консистенции и некоторым другим признакам.
Полужидкий агар (ПЖА). К 1000 куб.см. мясо-пептонного бульона добавляют 3-4 г агара и на слабом огне расплавляют при постоянном помешивании, фильтруют через тканевый фильтр до полной прозрачности, разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.
Готовый полужидкий агар охлаждают столбиком, среда должна быть совершенно прозрачной.
Полужидкий агар используют для определения подвижности микроорганизмов. С этой целью посев тест-культур проводят уколом в столбик среды, не прокалывая до дна 5-6 мм: подвижные культуры дают диффузный рост и вызывают помутнение всей питательной среды, неподвижные - растут по уколу, среда остается прозрачной, штаммы, обладающие слабой подвижностью, дают помутнение отдельных участков агара обычно вблизи укола.
Питательный желатин (МПЖ). К 1000 см3 мясо-пептонного бульона прибавляют 100 г пищевого желатина высшего сорта. После набухания желатина в течение 1-2 ч растворяют при медленном нагревании на водяной бане при температуре 40 - 50 °С до полного расплавления. Устанавливают pH 7,2 10 %-ным раствором бикарбоната натрия, фильтруют через бумажный фильтр в горячем виде. Если среда мутная, ее осветляют белком куриных яиц, после чего в горячем виде фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают в пробирки по 7 -8 см3, стерилизуют дробно 3 дня по 30 мин текучим паром или однократно при температуре 110 °С и давлении 0,04 МПа в течение 30 мин. После стерилизации среду охлаждают столбиком.
Среда предназначена для определения протеолитической активности микробов по разжижению желатина. Являясь растворимым белком, полученным из нерастворимого коллагена, под влиянием фермента желатиназы подвергается гидролизу и теряет свои желирующие свойства, в результате при низких температурах остается жидким.
Бульон Хоттингера. К 1000 см3 основного раствора добавляют 500 см3 водопроводной или дистиллированной воды, 3 г хлорида натрия и 0,12 г двузамещенного фосфата калия. Полученный раствор кипятят в течение 15-20 мин, устанавливают pH 7,2-7,4 и фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, затем разливают в колбы или пробирки и стерилизуют в течение 20-30 мин при температуре 120°С и давлении 0,1 МПа.
В бульоне Хоттингера изучают характер роста микроорганизмов в жидкой питательной среде.
Среда Мартена. Свежие свиные желудки освобождают от жира и содержимого и пропускают через мясорубку. На 250 г фарша добавляют 1000 см3 теплой (50 °С) кипяченой водопроводной воды и 10 см3 концентрированной соляной кислоты. Смесь выдерживают при температуре 45-50 °С в течение 24 ч, периодически взбалтывая, затем прогревают текучим паром 30 мин и оставляют в холодном месте на 5 сут. Надосадочную жидкость сливают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Полученный пептон Мартена хранят до 3 мес.
Из мяса крупного рогатого скота, освобожденного от жира и сухожилий, готовят фарш. К 500 г фарша добавляют 1000 см3 дистиллированной воды. Полученную смесь выдерживают при 4-8 °С в течение 24 ч, после чего кипятят на слабом огне 2 ч, постоянно подливая воду до первоначального объема. Фарш отжимают и удаляют, мясную воду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30-40 мин. Готовую среду хранят при температуре 4-8 °С до 3 мес.
Для приготовления жидкой среды смешивают равные объемы пептона Мартена и мясной воды, устанавливают pH 8,0-8,2, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Бульон хранят не более одного месяца.
Агар Мартена. В среду Мартена (бульон Мартена), подогретый до 50-60 °С, добавляют мелко нарезанный промытый агар-агар из расчета 25 г на 1000 см3, периодически помешивая, доводят жидкость до кипения для полного растворения агара. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем виде, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.
Бульон и агар Мартена предназначены для культивирования анаэробов и микоплазм.
