Метод определения Clostridium perfringens в пищевых продуктах

(по ГОСТ 10444.9-88)

1. Область применения:

Настоящая инструкция применяется сотрудниками лаборатории (бактериологического отдела), при необходимости определения Clostridium perfringens в пищевых продуктах.

2. Цель:

Выявление и определение Clostridium perfringens в пищевых продуктах в соответствие с ГОСТ 10444.9-88

Требования безопасности:

3.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности безопасность при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

3.2 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности безопасность при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) по ГОСТ Р ИСО 7218.

3.3 Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.1.004.

3.4 При работе с электроприборами необходимо соблюдать правила электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.

4. Метод:

1. Применяемые аппаратура, материалы и реактивы

- весы неавтоматического действия EW-1500i (для взвешивания реактивов);

- весы электронные KERN 440-43 (для взвешивания продукта);

- лупа с увеличением 5-10
- микроскоп для морфологических исследований «МИКМЕД-1» биологический с увеличением 900-1000
- петля бактериологическая;
- стекла предметные

- гомогенизатор лабораторный

- Аквадистиллятор электрический ДЭ-10
- Термостат-инкубатор с естественной конвекцией «BINDER» ВD 115, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.
- Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), с диапазоном измерения от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С.

- Шкаф сушильный ШС – 80-01 СПУ
- Спиртовка

- Емкости металлические или кастрюли, используемые для растворения, расплавления, нагревания или охлаждения питательных сред и воды.

- ножи;

- ножницы;
- палочки стеклянные
- пинцеты
- пипетки разной вместимости;
- плитка электрическая
- рН-метр;
- промывалка;

- Вата медицинская гигроскопическая

- Колбы мерные 2-50(100, 200, 500, 1000)

- Колбы конические Кн-2-100(250)-34 ТХС

- Цилиндры 1(2)-50(100)

- Пробирки П1, П2-16-150 ТС

- Чашки Петри 90 мм

- Стаканчики для взвешивания (бюксы)

- Пакеты для гомогенизации

- Вода дистиллированная

- Спирт этиловый ректификованный

- Стерилизатор паровой ВК-75-01

- Стерилизатор паровой ВК-75- ПЗ

- Холодильник-морозильник ХМ-4421-000-N «Атлант»

- Холодильник бытовой «Бирюса 542»

- Холодильник фармацевтический ХФ-250 «ПОЗИС»

- Холодильный шкаф «Хелкама» С5G

4.2 Питательные среды и реактивы

4.2.1 Раствор массовой концентрации неомицина сульфата 50 г/дм

4.2.2 Раствор массовой концентрации полимиксина В сульфата 2,5 и 5 г/дм³ или полимиксина М сульфата 5 г/дм

4.2.3 Раствор массовой концентрации циклосерина 40 г/дм

4.2.4 Агар триптозо-сульфит-циклосериновый

4.2.5 Растворы и реактивы для окрашивания по Граму и для выявления спор

4.2.6 Агар сульфит-полимиксин-неомициновый

4.2.7 Среда Вильсон Блера, измененная для анаэробов

4.2.8 Среда для анаэробов

4.2.9 Желатин-лактозная среда

4.2.10 Среда для изучения редукции нитратов и подвижности бактерий

4.2.11 Среду Роберта

4.2.12 Молоко лакмусовое

5. Отбор и подготовка проб

5.1. Отбор проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26809.

5.2. Подготовка проб пищевых продуктов к анализу по ГОСТ 26669.

Масса (объем) навески, предназначенной для приготовления гомогената продукта или исходного разведения - не менее (10,0±0,1) г (см).

Исходные разведения продуктов с массовой долей NaCI более 5% готовят с использованием пептонной воды; исходные разведения мясных, молочных продуктов и молока готовят с использованием физиологического раствора. Для приготовления последующих десятикратных разведений используют пептонно-солевой раствор. Пептонную воду и пептонно-солевой раствор готовят по ГОСТ 26669, физиологический раствор - по ГОСТ 10444.1.

Из пробы пищевого продукта, в котором нормируется количество С. perfringens, или его исходного разведения готовят ряд разведений в соответствии с допустимым количеством С. perfringens, указанном в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта. Культуральную жидкость разводят так, чтобы получить при высеве раздельные колонии.

6. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

6.1. Выявление характерных колоний

6.1.1. Для проведения испытания отбирают объем (1±0,1) см³ подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости.

Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей (штрихом) на поверхность питательной среды.

6.1.2. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают глубинным методом по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают триптозо-сульфит-циклосериновым или сульфит-полимиксин-неомициновым агаром, или сахарным кровяным агаром по Цейсслеру, или агаром Вильсон-Блера. Содержимое чашек Петри быстро, осторожными круговыми движениями перемешивают. После застывания среды чашки подсушивают и заливают той же средой так, чтобы высота второго слоя питательной среды была не менее 4 мм.

6.1.3. Посевы на чашках Петри термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч в анаэростатах с разряжением 0,6-0,8 атм [(0,4-0,6)·10⁵ Па] или в анаэробных условиях, указанных в ГОСТ 30425.

6.1.4. После окончания термостатирования отбирают те чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Подсчитывают количество выросших характерных колоний. Характеристика колоний С. perfringens на селективных питательных средах приведена в приложении.

Корректировку подсчета количества С. perfringens проводят после изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для С. perfringens.

6.2. Подтверждение принадлежности характерных колоний к С. perfringens.

6.2.1. Для подтверждения принадлежности обнаруженных колоний к С. perfringens отбирают произвольно не менее пяти, характерных для С. perfringens, колоний и пересевают их в жидкую (вязкую) среду для мезофильных анаэробных микроорганизмов.

Жидкие (вязкие) среды подготавливают к анализу по ГОСТ 30425.

Посевы термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч. Культуральную жидкость используют для изучения морфологических и биохимических свойств микроорганизмов.

6.2.2. Если колонии в посевах на чашках Петри растут в виде ковра или среди обнаруженных колоний много нетипичных для С. perfringens, то мазок из ковра или кажущиеся характерные колонии пересевают, как указано в п.6.2.1, в питательные жидкие (вязкие) среды для мезофильных анаэробов и термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч, полученную культуральную жидкость вновь высевают на чашки Петри (см. 6.1.2) так, чтобы получить раздельные колонии, предназначенные для определения культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, предположительно относящихся к С. perfringens. Питательные среды, используемые для вторичного посева на чашки Петри, не должны содержать циклосерина. Вторичные посевы термостатируют, как указано в п.6.1.3.

6.2.3. Из посевов (см. пп.6.2.1, 6.2.2) готовят препараты, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425 и микроскопируют. С. perfringens представляет собой грамположительные палочки размером 0,9-1,3х3,0-9,0 мкм, плохо или необразующие в посевах споры. Палочки с закругленными концами располагаются в одиночку, попарно, в виде цепочек штакетообразных скоплений.

В спороносных палочках спора расположена субтерминально. В посевах устанавливают отсутствие каталазы по ГОСТ 30425.

6.2.4. Культуры, указанные в пп.6.2.1, 6.2.2, высевают в пробирки с лакмусовым молоком. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 8-12 ч.

С. perfringens вызывает бурную ферментацию лактозы с образованием газа, редукцию лакмуса, коагуляцию молока с последующим его свертыванием и образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета в верхней части пробирки и просветлением сыворотки.

При инкубации посевов при температуре (45±1) °С характерную реакцию ферментации молока С. perfringens вызывают уже через 3-5 ч.

6.2.5. Исследуемую культуру высевают бактериологической петлей уколом в полужидкую питательную среду для изучения подвижности и редукции нитратов. Посев термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. С. perfringens неподвижен, он растет по ходу линии посева, не вызывая помутнения всей среды. После учета подвижности в эту же пробирку вносят реактив на нитриты. Редукцию нитратов оценивают по ГОСТ 10444.8. Культуры, которые показывают слабую реакцию на нитриты (т.е. розовый цвет), не учитывают, так как С. perfringens стойко дает сильную и немедленную реакцию (красный цвет).

6.2.6. Исследуемую культуру высевают бактериологической петлей уколом в питательную среду для определения способности к ферментации лактозы и разжижению желатина. Посев термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч. О ферментации лактозы свидетельствует желтое окрашивание среды и выделение пузырьков газа в толще среды. После учета ферментации лактозы пробирки с посевом выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 1 ч. Если среда вновь не застыла, то это свидетельствует о гидролизе желатина. При сохранении вязкости среды пробирку со средой вновь помещают в термостат с температурой (37±1) °С на 24 ч, охлаждают при температуре (4±2) °С и дают окончательную оценку способности выделенной культуры к гидролизу желатина.

С. perfringens ферментирует лактозу и, как правило, разжижает желатин.

6.2.7. Подвижность, редукцию нитратов, разжижение желатина допускается определять путем посева 6-8-часовой культуры, как указано в п.6.2.1 или 6.2.2 на среду Роберта. Среду непосредственно перед использованием прогревают 20 мин на кипящей водяной бане, охлаждают до застывания в холодильнике. В подготовленную среду посев проводят уколом. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24 ч, после этого посевы помещают на 20 мин в холодильник.

С. perfringens на среде Роберта образует прямую (вследствие неподвижности клеток) красную (вследствие редукции нитратов и появлению нитритов) линию, превращая среду в желеобразное состояние и не затвердевающую при температуре 2-4 °С в холодильнике (вследствие разжижения желатина).

7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

7.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

7.2. Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, выделенных из колоний, обнаружены неподвижные, грамположительные, каталазоотрицательные, редуцирующие нитраты, ферментирующие лактозу, разжижающие желатин и дающие характерный рост в лакмусовом молоке палочки, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относятся к С. perfringens.

7.3. При необходимости подсчета С. perfringens если в 80% случаев, т.е. не менее чем в четырех из пяти колоний, подтвержден рост С. perfringens, то считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке, принадлежат к С. perfringens. В остальных случаях количество С. perfringens определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения морфологических и биохимических свойств.

7.4. Результаты испытаний пересчитывают на 1 г или 1 см³ продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670..

8. Ответственность:

За выполнение данной инструкции несет ответственность сотрудник бактериологической лаборатории, выполняющий определение Clostridium perfringens в пищевых продуктах.

10. Ссылки и сокращения:

ГОСТ 26670-91 - Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (с Изменением N 1)

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями N 1, 2)